LASERMIKROSTRAHL UND OPTISCHE PINZETTE
 
 

Vorbemerkungen
Der Praktikumsversuch findet im Institut für Molekulare Biotechnologie (IMB), Beutenbergstraße 11 statt. Praktikanten melden sich bitte um 10.00 Uhr (bzw. in der im Praktikumsplan angegebenen Zeit) im Raum 353 (Betreuer), Raum 348 (Apparatur) oder Raum 351 (Sekretariat) (2.OG, mittlerer Gebäudeteil). 

Jeder Teilnehmer hat sich vor Versuchsbeginn anhand dieser Anleitung auf den Versuch vorzubereiten. Insbesondere muß er sich über das Thema Lasersicherheit und die für den Versuch geltenden Sicherheitsvorschriften informieren. Der entsprechende Kenntnisstand wird vom Praktikumsbetreuer überprüft. Bei Verstößen gegen Sicherheitsvorschriften wird der Betreuer den Versuch abbrechen. Kenntnisse zum Aufbau der Pflanzenzelle und der Pollenwand sowie Grundkenntnisse über den optischen Aufbau und die Funktion eines Lichtmikroskops werden vorausgesetzt.

Zum Praktikumsversuch ist von jeder Gruppe eine frische Zwiebel und ein Gläschen mit ca. 12 Stunden in Leitungswasser eingelegten frischen Lilien- oder Tulpenpollen mitzubringen. Gruppen, die an einer Videoaufzeichnung ihres Versuchs interessiert sind, bringen bitte eine VHS-Videokassette mit.

Falls noch Fragen zum Praktikumsort oder zur Versuchsvorbereitung auftreten, können diese telefonisch an den jeweiligen Praktikumsbetreuer gestellt werden: Frau Monajembashi (03641/656402), Herr Grigaravicius (03641/656402) oder Herr Schellenberg (03641/656112).
 
 

Einleitung

Der Versuch "Lasermikrostrahl und optische Pinzette" beschäftigt sich mit der Verwendung von Licht zum Bewegen und zur Mikromanipulation mikroskopischer Partikel.

Allgemeines über Licht

Licht kann physikalisch als elektromagnetische Welle beschrieben werden. Die Wellenlänge bestimmt die Farbe des Lichts.
 
 
 

Wellenlänge	Spektralbereich	Farbeindruck
750 nm - 1 mm	Infrarot (IR)	unsichtbar
700 nm	Sichtbar	rot
620 nm	Sichtbar	orange
580 nm	Sichtbar	gelb
530 nm	Sichtbar	grün
470 nm	Sichtbar	blau
420 nm	Sichtbar	violett
350 nm - 1 nm	Ultraviolett (UV)	unsichtbar

Tabelle 1: Ausgewählte Wellenlängen aus dem optischen Spektrum
 
 

Je kürzer die Wellenlänge des Lichts ist, um so energiereicher ist es. Blaues Licht ist also energiereicher als rotes.

Trifft Licht auf Materie, so findet in der Regel Absorption statt. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes kann man berechnen, wie stark das Licht beim Durchgang durch einen Stoff geschwächt wird, d. h. welcher Bruchteil der Lichtenergie vom Stoff absorbiert wird:

log(I/I0) = -e .[J].l.

I0 Lichtintensität vor Stoffdurchgang
(Intensität = Leistung/Fläche)
I Lichtintensität nach Stoffdurchgang der Länge l
[J] Stoffkonzentration
e molarer Absorptionskoeffizient (Extinktionskoeffizient) der Substanz J bei der Wellenlänge des absorbierten Lichts

Die absorbierte Lichtenergie wird in der Regel in Wärme umgesetzt. Stoffe absorbieren nicht alle Lichtwellenlängen gleich stark. Das Absorptionsspektrum gibt an, welche Lichtwellenlängen von einer Substanz in welcher Stärke absorbiert werden und ist daher ein wichtiges Mittel zur Charakterisierung von Substanzen. Die molaren Absorptionskoeffizienten der Stoffe sind also wellenlängenabhängig.

Unter Energiedichte versteht man die Lichtenergie pro Volumen. Bündelt (fokussiert) man einen Lichtstrahl bestimmter Energie, so ist die lokale Energiedichte im gebündelten Lichtstrahl höher, als im ungebündelten.

Unter Leistung versteht man allgemein Energie (oder Arbeit) pro Zeiteinheit. Betrachtet man die Energiedichte in einem Volumen pro Zeiteinheit, so kommt man zur Leistungsdichte. Dies hat praktische Bedeutung, die am folgenden Beispiel erläutert werden soll. Eine bestimmte Menge Lichtenergie trifft auf einen Körper und wird von diesem absorbiert. Der Körper heizt sich auf. Wird die gleiche Energiemenge in kürzerer Zeit und auf einen kleineren Punkt (also fokussiert) auf den Körper gelenkt, so wird der Körper sich an dieser Stelle während der Bestrahlung stärker aufheizen als im ersten Fall, denn es steht lokal und pro Zeiteinheit mehr Lichtenergie zur Verfügung. Im Extremfall kann die lokale Leistungsdichte so hoch sein, daß sich die bestrahlte Substanz auf eng begrenztem Raum so stark erhitzt, daß an dieser Stelle ein Plasma (ionisiertes Gas) entsteht. Wählt man sehr energiereiches Licht (z. B. UV), so können chemische Bindungen nichtthermisch getrennt werden. Man beachte, daß man durch Fokussieren die Energiedichte eines Lichtstrahls erhöhen kann, jedoch nicht die Energie des Lichts selbst. Diese ist nur von der Wellenlänge abhängig. Im Lasermikrostrahl wird durch extremes Fokussieren die lokale Energie- bzw. Leistungsdichte des Lichtstrahls auf sehr eng begrenztem Raum so erhöht, daß mikroskopische Materialien mit dem Lichtstrahl bearbeitet werden können.

Laser

Laser erzeugen monochromatische, kohärente, stark gebündelte (parallele) und zum Teil sehr intensive Lichtstrahlen. Monochromasie bedeutet, daß das Licht durch eine scharfe Wellen-länge charakterisiert wird. Lichtwellen sind kohärent, wenn die Zeitabhängigkeit ihrer Amplitude bis auf eine Phasenverschiebung gleich ist. Physikalische Grundlage des Lasers ist die stimulierte Emission von Licht im Lasermedium. (Sie ist der Umkehrprozeß der Absorption, d. h., durch resonante Strahlung wird ein Elektron von einem energetisch höheren in ein tieferes Niveau gezwungen. Die frei werdende Energie wird in Form eines Lichtquants abgestrahlt. Das entstehende Licht hat die gleiche Wellenlänge und Phase wie das einfallende und auch die gleiche Richtung.) Es ist üblich, Lasertypen nach dem verwendeten Lasermedium zu bezeichnen, z. B. Stickstoff-Laser oder Helium-Neon-Laser.

Monochromasie, Parallelität und Kohärenz des Laserlichts sind für den Lasermikrostrahl die wichtigsten Eigenschaften. Dadurch ist nämlich Fokussierung eines Laserstrahls auf einen Brennfleck möglich, der nur geringfügig größer ist als der beugungsoptisch bedingte Durchmesser von etwa einer Wellenlänge.

Man unterscheidet zwischen Lasern, die ihre Strahlung kontinuierlich abgeben (engl.: "cw" - continuous wave) und gepulsten Lasern. Bei gepulsten Lasern wird die Lichtenergie in sehr kurzen, regelmäßigen Zeitintervallen ausgesendet. Die Repetitionsrate ist durch die Anzahl der Laserpulse pro Zeiteinheit bestimmt. Man spricht von Laserpulsen (häufig auch Laserimpulsen). Es sind Pulsdauern von nur wenigen Femtosekunden (10-15 Sekunden) möglich, wodurch sich extrem hohe Spitzenleistungen pro Laserpuls erreichen lassen. Bei konstanter Pulsenergie ist die Pulsleistung nämlich umso höher, je kürzer der Laserpuls ist (Leistung = Energie / Zeit).
 
 
 

Lasertyp	Wellenlänge	Mittlere Leistung	Pulsspitzen-leistung	Pulsdauer, Rep.-Rate
Excimerlaser	308 nm		100 mJ/Puls	20 ns, 20 Hz
Stickstofflaser	337 nm	12 mW	2,4 MW	500 ps, 10 Hz
Argonionenlaser	488 nm/514 nm		nicht gepulst	nicht gepulst
HeNe-Laser	633 nm		nicht gepulst	nicht gepulst

Tabelle 2: Typische (Puls-)Spitzenleistungen einiger Laser

Rechenbeispiel: mittlere Leistung 12 mW, Pulsdauer 500 ps, Rep.-Rate 10 Hz (P: Leistung, W: Energie, t: Zeit).

Dies bedeutet, daß in einer Sekunde 10 Pulse abgegeben werden können und innerhalb von einer Sekunde eine Energie von 12 mJ (entspricht einer mittleren Leistung von 12 mW) vorhanden ist. Auf die 10 Pulse aufgeteilt ergibt dies eine Pulsenergie von 1,2 mJ, welche bei einer Pulsdauer von 500 ps zu einer Pulsspitzenleistung von 2,4 MW führt.

P= W / t => WSekunde = 12 mJ
WPuls = 12 mJ/10 = 1,2 mJ
PPuls = 1,2 mJ / 500 ps = 2,4 MW
 
 

Optische Pinzette und Lasermikrostrahl

Ein biologisches Objekt verhält sich wie eine Linse, d. h., Lichtstrahlen werden an ihm gebrochen. Durch die Richtungsänderung der Strahlen wird auf das Objekt ein Impuls übertragen. Im Mikroskop entsteht kein homogener Lichtstrahl, wenn Laserstrahlen als optische Pinzette eingekoppelt werden. Teilstrahlen, die näher an der optischen Achse liegen, sind intensiver. Sie übertragen auch einen höheren Impuls auf das Objekt (Strahl a in der folgenden Abbildung, entnommen aus Literaturstelle [1], siehe weiter unten). Die resultierende Kraft auf das Objekt zieht das Objekt auf die optische Achse in den Fokus. Das Objekt wird dort gehalten, solange ein ausreichend starker Lichtstrahl einwirkt. Die Umgebung des Objekts läßt sich dann gegen das Objekt selbst verschieben.

Der durch Licht auf einen Partikel wirkende Lichtdruck P (Kraft pro Fläche) kann berechnet werden durch die Formel

P = g · I /c.

Die Kraft auf den Partikel ergibt sich als

F = g · W /c.

g ist ein dimensionsloser Faktor zwischen 1 (für Objekte, die das Licht völlig absorbieren) und 2 (für perfekt spiegelnde Objekte). I ist die Lichtintensität in Watt/cm2, W die Lichtleistung in Watt. c ist die Lichtgeschwindigkeit. Die senkrecht zur optischen Achse wirkende Kraft, die den Partikel also auf die optische Achse zieht, beträgt etwa 1-10% der oben berechneten Kraft.
 
 

Abbildung 1: Kräfte in der optischen Pinzette
 
 

Der Lasermikrostrahl wird oft auch als "optisches Skalpell" oder "Laserskalpell" bezeichnet, weil mit ihm mikroskopische Materialbearbeitung, wie z. B. Schnitte, durchgeführt werden können. Der Lasermikrostrahl unterscheidet sich von der optischen Pinzette lediglich durch Wellenlänge, Energie und Fokussierung des verwendeten Laserlichts. Das zu bearbeitende Objekt muß für die Wellenlänge des Lasermikrostrahls eine hohe Absorption besitzen. Dies ist bei Wellenlängen im UV in der Regel der Fall (z. B. 337 nm, Stickstofflaser). Durch die hohe Fokussierung des Mikroskopobjektivs wird eine Leistungsdichte erreicht, die zur lokal begrenzten Zerstörung des Objekts führt. Hier werden häufig kurz gepulste Laser eingesetzt, da diese eine hohe Pulsspitzenleistung bei geringer Pulsenergie besitzen können. Im Fokus des Lasers können sich die bestrahlten Objekte durch die hohe Pulsspitzenleistung sehr lokal begrenzt um Temperaturen von einigen Millionen Kelvin aufheizen. Die gesamte im Objekt absorbierte Energie kann jedoch gering gehalten werden. Nach wenigen Nanosekunden hat sich die Wärme in die Umgebung verteilt und der Temperaturanstieg des Objekts insgesamt ist gering genug, um es nicht zu zerstören. Dies ermöglicht hochpräzise Mikromaterialbearbeitungen ohne unerwünschte Schädigung der Umgebung.

Die folgende Abbildung ist entnommen aus einer Publikation von Greulich und Leitz 1994 (siehe Literaturhinweise). Sie soll verdeutlichen, wie Lasermikromaterialbearbeitung an ungeöffneten biologischen Objekten möglich ist. Die Energiedichte (in der Abbildung als "High Photon Density" bezeichnet) ist nur im Fokus ausreichend hoch, um biologische Materialien zu zerstören. Wenn z. B. die Zellwand durchlässig für den Laserstrahl ist, können durch sie hindurch in der Zelle Organellen bearbeitet werden.

Wichtig ist der Einsatz von Mikroskopobjektiven mit hoher numerischer Apertur. Von einem punktförmigen Objekt gehen Lichtstrahlen durch das Mikroskopobjektiv. Man denke sich einen Lichtkegel. Der Sinus des Öffnungswinkels dieses Kegels, multipliziert mit dem Brechungsindex des umgebenden Mediums (bei Luft Å 1), wird als numerische Apertur bezeichnet. Objektive, die stark fokussieren (sie erzeugen also einen gedanklichen Lichtkegel mit großem Öffnungswinkel) haben numerische Aperturen sehr nah beim Wert 1.
 
 

Weiterführende Literatur

(wird zur Versuchsvorbereitung nicht verlangt)

[1] Karl Otto Greulich, Günther Leitz: Light as microsensor and manipulator: laser microbeams and optical tweezers. Experimental Technique of Physics, Volume 40 (1994), No. 1, 1-14.

[2] Shamci Monajembashi, Carsten Hoyer, Karl Otto Greulich: Microbeams and optical Tweezers convert the microscope into a versatile microtool. Microscopy and Analysis, Januar 1997, 7-9.

[3] Karl Otto Greulich: Micromanipulation by Light in Biology and Medicine. Birkhäuser Verlag, 1999.
 
 

Abbildung 2: Bearbeitung von Objekten innerhalb von geschlossenen, lebenden Zellen mit dem Lasermikrostrahl
 
 
 
 

Versuchsdurchführung

Überblick

Der im Folgenden beschriebene Versuch beschäftigt sich mit der Verwendung von Licht zum Bewegen und Schneiden mikroskopischer Partikel. Folgende Aufgaben sind vorgesehen:

1. Eichung der Apparatur. Bestimmung der Abhängigkeit von applizierter Laserleistung und Strukturschädigung anhand einer Farbstoffschicht.

2. Bewegen von mikroskopischen Latexkugeln verschiedener Größe in wässriger Umgebung mit der optischen Pinzette.

3. Präparate aus Zwiebelschuppenepidermis. Abbildung und Versuch der Bewegung von subzellulären Partikeln mit der optischen Pinzette sowie Schneiden der Zellwand und intrazellulärer Plasmastränge mit dem Lasermikrostrahl.

4. Präparate aus Lilienpollen. Zerstören der Pollenexine und des gekeimten Pollenschlauchs mit dem Lasermikrostrahl.

5. (Wenn noch Zeit bleibt) Laserinduzierte Zellfusion an Zellen aus einer in der Abteilung gepflegten Zellkultur.
 
 

Versuchsablauf

Zunächst sollte sich jeder Praktikumsteilnehmer vor Versuchsbeginn mit der Apparatur vertraut machen. Wichtig sind inverses Mikroskop, Präparattisch, Strahlengänge, Videoaufzeichnungssystem, optische Pinzette (Nd:YAG-Laser) und Lasermikrostrahl (Stickstofflaser). Die Bedienung der Geräte und der Versuchsablauf im Einzelnen wird vom Praktikumsbetreuer vor Ort erläutert. Es sei an dieser Stelle ausdrücklich auf den folgenden Abschnitt "Lasersicherheit" dieser Versuchsanleitung hingewiesen.

Jede Versuchsaufgabe wird zuerst mit dem Betreuer besprochen und dann weitgehend selbständig durchgeführt. Vom Versuchsablauf soll während des Versuchs ein ordentliches Protokoll angefertigt werden, welches am Ende testiert wird. Die Ergebnisse von Aufgabe 1 sollen in einem Diagramm dargestellt werden. Alle anderen Versuchsergebnisse sollen in wenigen Sätzen und einfachen Skizzen beschrieben werden. Als Hilfe hierzu können Videoaufzeichnungen der mikroskopischen Arbeiten dienen (Aufzeichnungs-möglichkeit ist vorhanden).
 

Abbildung 3: Schematische Darstellung der für das Praktikum zur Verfügung stehenden Apparatur.

Lasersicherheit

Die im Praktikumsversuch eingesetzten Laser senden sichtbare und unsichtbare Laserstrahlung aus. Die Strahlung kann sehr intensiv sein, so daß selbst an metallischen oder gläsernen Flächen (Armbanduhr!) reflektierte Strahlung irreversible Schäden an Augen oder Haut auslösen kann. Bei Laserbetrieb haben deshalb alle im Raum anwesenden Personen geeignete Schutzbrillen zu tragen. Jeder muß anhand der Aufschrift auf der Brille prüfen, ob diese für die vorhandene Laserstrahlung ausreichend Schutz bietet. Alle Fenster und Türen sind zu verdunkeln, um Personen außerhalb der Labors nicht zu gefährden. Die Laserwarnlampe vor der Labortür ist einzuschalten. Vor Inbetriebnahme eines Lasers sind alle im Raum anwesenden Personen davon in Kenntnis zu setzen. Die Inbetriebnahme eines Lasers darf erst erfolgen, wenn alle notwendigen Sicherheitsmaßnahmen erfolgt sind (Verdunkelung, Schutzbrillen) und der Praktikumsbetreuer der Inbetriebnahme zugestimmt hat.

Weiterhin darf an den aufgebauten Strahlengängen nichts verändert werden. Jeder Versuchsteilnehmer hat sich vor Arbeitsbeginn über die Strahlengänge in der Praktikumsapparatur zu informieren. Besondere Gefährdung durch Laserstrahlung ist am Ort des Präparats über dem Objektiv und am Okular. Deshalb gilt: niemals während Laserbertieb in das Okular schauen, am Präparat hantieren, in Strahlengänge fassen oder den Kopf über dem Präparat oder in Präparatnähe halten. Die Beobachtung des Versuchsablaufs erfolgt ausschließlich über Videokamera und Monitor.